Những chiếc B-25B bên trên USS Hornet trên đường đến Nhật Bản

Ngày 1 tháng 4, 16 chiếc máy bay được cải tiến, đội bay năm người mỗi chiếc cùng các nhân viên kỹ thuật Không lực với tổng cộng 71 sĩ quan cùng 130 hạ sĩ quan và binh sĩ,[13] được cho chất lên tàu sân bay Hornet tại Alameda. Mỗi máy bay mang theo bốn quả bom 225 kg (500 lb) được chế tạo đặc biệt cho nhiệm vụ này: ba trong số đó là bom nổ công phá cao và một quả là bom cháy, vốn là những ống cháy dài được bó lại để có thể chứa trong khoang chứa bom, nhưng được thiết kế để được tách ra sau khi thả và phân tán trên một khu vực rộng. Có năm quả bom được đính kèm những huy chương "hữu nghị", là phần thưởng mà Chính phủ Nhật từng trao tặng cho quân nhân Mỹ trước chiến tranh.[16] Vũ khí trang bị cho những chiếc máy bay ném bom được giảm bớt hầu có thể giảm trọng lượng, và nhờ đó gia tăng tầm bay xa. Mỗi chiếc máy bay ném bom được phóng lên với hai súng máy 12,7 mm (0,50 caliber) bố trí trong tháp súng bên trên và một súng máy hạng nhẹ 7.62 mm (0,30 caliber) trước mũi. Một nòng súng giả được gắn ở chóp đuôi, dự định để làm nản lòng những cuộc tấn công của máy bay Nhật từ phía sau, mà sau này được ghi nhận trong báo cáo của Doolittle là đặc biệt có hiệu quả.[10] Những chiếc máy bay được cho dồn lại và cột chắc chắn vào sàn tàu của Hornet theo thứ tự được dự định sẽ phóng lên.

Với mệnh lệnh cầm trên tay, Đại tá Hải quân Marc A. Mitscher, thuyền trưởng USS Hornet, đang trao đổi với Trung tá James Doolittle.

Hornet và Lực lượng Đặc nhiệm 18 rời cảng Alameda lúc 10 giờ 00 ngày 2 tháng 4 và vài ngày sau đó đã gặp gỡ Lực lượng Đặc nhiệm 16, dưới quyền chỉ huy của Phó Đô đốc William F. Halsey, Jr., bao gồm tàu sân bay Enterprise cùng các tàu tuần dương và tàu khu trục hộ tống cho nó giữa Thái Bình Dương về phía Bắc Hawaii. Máy bay tiêm kích và máy bay trinh sát của Enterprise yểm trợ trên không cho toàn thể lực lượng đặc nhiệm trong trường hợp có một cuộc tấn công của Nhật Bản, vì toàn bộ máy bay tiêm kích của Hornet được chứa bên dưới hầm tàu nhường chỗ cho những chiếc B-25 sử dụng sàn đáp bên trên. Lực lượng phối hợp bao gồm hai tàu sân bay, ba tàu tuần dương hạng nặng, một tàu tuần dương hạng nhẹ, tám tàu khu trục và hai tàu chở dầu hạm đội. Các con tàu hộ tống Salt Lake City, Northampton, Vincennes, Nashville, Balch, Fanning, Benham, Ellet, Gwin, Meredith, Grayson, Monssen, Cimarron và Sabine sau đó di chuyển với sự in lặng vô tuyến tuyệt đối. Trưa ngày 17 tháng 4 các tàu chở dầu chậm chạp tiếp nhiên liệu cho lực lượng đặc nhiệm, rồi cùng với các tàu khu trục rút lui về hướng Đông, trong khi các tàu sân bay và tàu tuần dương băng nhanh về hướng Tây với tốc độ 37 km/h (20 knot), đến điểm dự định xuất phát trong vùng biển do đối phương kiểm soát về phía Tây Nhật Bản.[17]

Chiếc B-25 của Doolittle đang cất cánh từ sàn đáp của USS Hornet, bắt đầu nhiệm vụ của họ đến Nhật Bản.

Lúc 7 giờ 38 phút sáng 18 tháng 4, khi lực lượng đặc nhiệm còn cách Nhật Bản khoảng 1.050 km (650 dặm), nó bị một tàu tuần tra Nhật Bản trông thấy và gửi một bức điện cảnh báo tấn công về chính quốc.[18] Chiếc Dai-23 Nittō Maru là một tàu tuần tra tải trọng 70 tấn, được chỉ huy bởi một hạ sĩ quan vốn đã tự sát thay vì để bị bắt khi con tàu bị đánh chìm. Năm trong số mười một thành viên thủy thủ đoàn còn sống sót khi họ được chiếc tàu tuần dương hạng nhẹ Nashville vớt lên.[19] Cho dù con tàu bị hỏng nặng và bị đánh chìm bởi hải pháo của Nashville,[20] do lo ngại về khả năng Nhật Bản sẽ được báo động bởi thông tin từ chiếc tàu tuần tra; Doolittle hội ý với Thuyền trưởng của Hornet, Đại tá Marc Mitscher, và quyết định tung ra những chiếc B-25 ngay lập tức, 10 giờ sớm hơn và cách xa Nhật Bản hơn 270 km (170 dặm) so với kế hoạch.[21] Sau khi sắp xếp lại để có chỗ khởi động và làm nóng động cơ, máy bay của Doolittle chỉ có khoảng đường băng để cất cánh dài 142 m (467 ft).[22] Cho dù trong thực tế chưa có phi công B-25 nào, kể cả Doolittle, từng cất cánh từ một tàu sân bay trước đó, tất cả 16 chiếc máy bay đều cất cánh an toàn từ 8 giờ 20 phút đến 9 giờ 19 phút. Chiếc B-25 thứ 16 chỉ được đưa theo như để dự trữ, được dự tính bay kèm theo như một nền tảng trinh sát và chụp ảnh, nhưng khi yếu tố bất ngờ bị thử thách, Doolittle quyết định sử dụng tất cả 16 chiếc máy bay vào nhiệm vụ tấn công.[23] Đây là lần duy nhất trong lịch sử mà máy bay ném bom của Không lực Lục quân Hoa Kỳ được phóng từ một tàu sân bay của Hải quân Hoa Kỳ trong một phi vụ chiến đấu.

Những chiếc B-25 bắt đầu bay về phía Nhật Bản, hầu hết theo nhóm từ hai đến bốn chiếc trước khi tách ra từng chiếc một ở độ cao ngay bên trên mặt sóng biển nhằm tránh bị phát hiện.[24] Những chiếc máy bay bắt đầu đến bên trên bầu trời Nhật Bản vào lúc giữa trưa (giờ Tokyo, sáu giờ sau khi phóng lên), và đã ném bom xuống 10 mục tiêu quân sự và công nghiệp tại Tokyo, hai tại Yokohama, cùng Yokosuka, Nagoya, Kobe và Osaka mỗi nơi một mục tiêu. Cho dù một số chiếc B-25 phải chịu đựng hỏa lực phòng không hạng nhẹ và một ít máy bay tiêm kích bên trên bầu trời Nhật Bản, không có chiếc máy bay ném bom nào bị bắn rơi, và chỉ có chiếc B-25 của Trung úy Richard O. Joyce bị hư hại nhẹ do hỏa lực phòng không.[22] Máy bay số 4 do Trung úy Everett W. Holstrom điều khiển buộc phải phóng bỏ các quả bom trước khi đến được mục tiêu khi bị máy bay tiêm kích đối phương tấn công do tháp súng của nó gặp trục trặc không thể vận hành.[25]

Sau đó 15 trong số 16 máy bay tiếp tục bay về hướng Tây Nam dọc theo bờ biển phía Nam Nhật Bản và vượt qua biển Đông Trung Quốc hướng về phía Đông Trung Quốc, nơi nhiều sân bay tại tỉnh Chiết Giang được dự định sẵn sàng để dẫn đường cho họ nhờ vào các cột mốc dẫn đường hàng không, hạ cánh và được tiếp nhiên liệu trước khi tiếp tục bay đến Trùng Khánh, thủ đô thời chiến của Trung Quốc dưới quyền Quốc Dân Đảng.[13] Căn cứ chủ yếu đặt tại Chu Châu, hướng mà mọi chiếc máy bay được dẫn đường để đến đó; tuy nhiên Halsey đã không gửi bất kỳ tín hiệu nào báo trước theo kế hoạch, rõ ràng là vì mối đe dọa có thể xảy ra đối với lực lượng đặc nhiệm. Một chiếc B-25, thiếu hụt nhiên liệu nghiêm trọng, đã quyết định bay về phía lục địa nước Nga ở gần hơn về phía Tây Bắc.

Các đội bay đối mặt với vô số thử thách không thể lường trước trong chặng bay đến Trung Quốc: bóng đêm ập đến, nhiên liệu sắp cạn và thời tiết xấu đi rõ rệt. Không ai đã có thể tiếp tục bay đến được Trung Quốc nếu như không có một cơn gió mạnh ngẫu nhiên phía đuôi khi họ vừa rời khỏi mục tiêu, giúp gia tăng tốc độ bay thêm được 46 km/h (25 knot) trong vòng bảy giờ.[26] Do hậu quả của những vấn đề này, các đội bay ý thức rằng họ không thể nào bay đến được các căn cứ được dự tính tại Trung Quốc, chỉ cho họ cơ hội lựa chọn nhảy dù lên vùng đất phía Đông Trung Quốc hoặc đáp xuống dọc theo bờ biển Trung Quốc.[10][27] Mười lăm chiếc máy bay đã bay đến được bờ biển Trung Quốc sau 13 giờ bay và đã rơi khi hạ cánh hoặc nhảy dù; một đội bay đã đi đến khu vực Viễn Đông nước Nga, và đã hạ cánh ở địa điểm cách Vladivostok 65 km (40 dặm) về phía Bắc, nơi chiếc B-25 của họ bị tịch thu và đội bay bị bắt giữ trước khi họ tìm cách thoát được qua ngã Iran vào năm 1943.[2][3] Đây là phi vụ chiến đấu dài nhất từng được kiểu máy bay ném bom tầm trung B-25 Mitchell thực hiện, với khoảng cách trung bình 3.600 km (2.250 dặm).

Doolittle và các đội bay của mình, sau khi nhảy dù an toàn xuống Trung Quốc, đã nhận được sự giúp đỡ của binh lính và thường dân Trung Hoa, cũng như của John Birch, một nhà truyền giáo người Mỹ tại Trung Quốc. Giống như tất cả những người tham gia phi vụ, Doolittle cũng đã phải nhảy dù thoát ra nhưng may mắn rơi xuống một đống phân trong một ruộng lúa gần Cù Châu, nên đã cứu được mắt cá chân của mình từng bị chấn thương trước đây. Doolittle cho rằng phi vụ này đã thất bại thảm hại vì những chiếc máy bay đã bị mất, và ông cho rằng mình sẽ bị đưa ra toà án binh khi trở về nhà.[28] Doolittle sau đó đề nghị Birch bí mật tiếp xúc với Đội Phi Hổ (Flying Tigers) của Tướng Claire Chennault.